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2024年食品安全監(jiān)督抽檢實施細則中要求對醬油、食醋、釀造醬、葡萄酒等14種食品進行三氯蔗糖測定，其中冷凍飲品、其他蒸餾酒檢驗項目中，三氯蔗糖作為2024年新增項目。檢測方法中均選定GB 22255-2014、GB 5009.298-2023兩個食品安全國家檢測標準，并要求2024年3月6日之前使用GB 22255-2014檢測，2024年3月6日（含）之后使用GB 5009.298-2023檢測，或根據檢驗日期選擇現(xiàn)行有效的檢測方法進行檢測。
《GB 5009.298-2023 食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》于2023年9月6日發(fā)布，2024年3月6日實施，替代《GB 22255-2014食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》。新標準與老標準相比，第一法高效液相色譜法調整了樣品分類、稱樣量范圍、檢出限和定量限，仍然保留了75%甲醇水提取濃縮、液液萃取等復雜的前處理過程；增加了第二法"高效液相色譜-串聯(lián)質譜法"。
迪馬科技多年來一直關注食品中三氯蔗糖測定的相關問題，并提供完整的解決方案。之前發(fā)布過三氯蔗糖解決方案，參考標準《GB 22255-2014》重現(xiàn)了國標方法，詳細解決方案可去迪馬科技查詢：食品中三氯蔗糖的測定——HPLC法解決方案。
參考即將實施的標準《GB 5009.298-2023食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》重現(xiàn)了國標方法，并對醬油、醋、甜面醬等容易產生雜質干擾的樣品，以及高含量樣品，進行前處理方法優(yōu)化。
優(yōu)化方案中乙酸鉛作為沉淀劑，純水提取，可避免標準中提取為75%甲醇水溶液濃縮時間長、液液萃取等復雜過程，簡化了前處理流程，提高了樣品檢測效率。兩種檢測方法如下：
第一法：高效液相色譜法：采用ProElut® PLS 200mg/6mL(Cat.#:68012)凈化，Bio-Bond® C18 250×4.6mm，5μm(Cat.#:84006)色譜柱分離，蒸發(fā)光散射檢測器檢測。
第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質譜法：液相色譜-串聯(lián)質譜法采用ProElut® PLS 200mg/6mL(Cat.#:68012)凈化，Leapsil® C18 100x4.6mm，2.7μm(Cat.#:86002)色譜柱分離測定，以下為部分實驗結果，供廣大客戶參考。
第一法：高效液相色譜法
1、適用范圍
本方案適用于紅酒、棒棒糖、蜜餞、綠豆糕、醬油、醋和甜面醬中三氯蔗糖的檢測，紅酒方法定量限20mg/kg，棒棒糖、蜜餞、綠豆糕、醬油、醋和甜面醬方法定量限30mg/kg。
2g樣品，旋蒸至干，用1mL水溶解，經0.45μm親水PTFE濾膜過濾后，待測。
2.2 糖果、蜜餞試樣（棒棒糖、半邊梅）
2g樣品，加入5mL水，振蕩3min，加入15mL甲醇，0.5mL乙酸鋅和0.5mL亞鐵氰化鉀溶液，繼續(xù)振蕩30s，經60℃水浴加熱15min，超聲提取20min，3000rpm離心10min，將上清液移入50mL離心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振蕩30s，3000rpm離心10min，重復提取2次，合并上清液。將全部上清液轉移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振搖2min，靜置分層20min，取下層液體在50℃下減壓蒸至1mL左右，用9mL水分3次沖洗旋蒸瓶，沖洗液合并至15mL離心管中，超聲處理5min，3000rpm離心10min，待凈化。2.3 醋、醬油、醬及醬制品類試樣（醬油、醋、甜面醬）
2g樣品，加入1.0g中性氧化鋁，加入5mL水，振蕩3min，加入15mL甲醇，繼續(xù)振蕩30s，超聲提取20min，3000rpm離心10min，將上清液移入50mL離心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振蕩30s，3000rpm離心10min，重復提取2次，合并上清液。將全部上清液轉移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振搖2min，靜置分層20min，取下層液體在50℃下減壓蒸至1mL左右，用9mL水分3次沖洗旋蒸瓶，沖洗液合并至15mL離心管中，超聲處理5min，3000rpm離心10min，待凈化。
2.4 其他試樣（綠豆糕）
2g樣品，加入5mL水，振蕩3min，加入15mL甲醇，0.5mL乙酸鋅和0.5mL亞鐵氰化鉀溶液，繼續(xù)振蕩30s，超聲提取20min，3000rpm離心10min，將上清液移入50mL離心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振蕩30s，3000rpm離心10min，重復提取2次，合并上清液。將全部上清液轉移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振搖2min，靜置分層20min，取下層液體在50℃下減壓蒸至1mL左右，用9mL水分3次沖洗旋蒸瓶，沖洗液合并至15mL離心管中，超聲處理5min，3000rpm離心10min，待凈化。
3、標準品配制
標準儲備溶液：準確稱取標準品，用水配制成10mg/mL的儲備液，吸取一定體積10mg/mL儲備液用水配成濃度為1000μg/mL的儲備液。
(1)活化：依次向柱中加入4mL甲醇、4mL水，棄去流出液；
(2)上樣：將待凈化液加入柱中，棄去流出液（控制流速不超過每秒1滴）；(3)淋洗：柱上液面為2mm左右時加入1mL水；
(4)洗脫：3mL甲醇洗脫;(5)定容：將洗脫液在50℃下減壓蒸干，用乙腈水（11+89）定容至1mL，疏水PTFE濾膜過濾，供HPLC分析。
流速：1.0mL/min
進樣量：20μL柱溫：35℃
檢測器：ELSD溫度：40℃
壓力：4.0barGain：4
流動相：A：水；B：乙腈，A:B=89:11。當檢測樣品基質復雜，強保留物質影響后續(xù)檢測時，可采取梯度洗脫程序，梯度設置如下：
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6、添加回收結果及色譜圖
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1、適用范圍
本方案適用于醬油、醋、甜面醬中三氯蔗糖的檢測，方法定量限30mg/kg。(針對國標方法重現(xiàn)GB 5009.298-2023第一法5.2.2 醋、醬油、醬及醬制品類試樣在目標峰出峰位置附近雜質干擾、基線不平，低濃度不便于定量的問題，對前處理方法進行了優(yōu)化和簡化。）
3、標準品配制
標準儲備溶液：準確稱取標準品，用水配制成10mg/mL的儲備液，吸取一定體積10mg/mL儲備液用水配成濃度為1000μg/mL的儲備液。
(1)活化：依次向柱中加入5mL甲醇、5mL水，棄去流出液；
(2)上樣：將待凈化液加入柱中，棄去流出液（控制流速不超過每秒1滴）；(3)淋洗：向柱中加入5mL 20%甲醇水溶液，棄去流出液；
(4)洗脫：向柱中加入3mL甲醇，收集流出液；(5)定容：將洗脫液在50℃下減壓蒸干，用流動相定容至1mL，疏水PTFE濾膜過濾，供HPLC分析。
流速：1.0mL/min
進樣量：20μL柱溫：35℃
檢測器：ELSD溫度：40℃
壓力：4.0barGain：4
流動相：A:水；B:乙腈，A:B=89:11。當檢測樣品基質復雜，強保留物質影響后續(xù)檢測時，可采取梯度洗脫程序，梯度設置如下：
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6、添加回收結果及色譜圖
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7、小結
對前處理方法進行了優(yōu)化和簡化后，相比于GB 5009.298-2023第一法，醬油樣品和甜面醬樣品基線更平、目標峰附近無雜質干擾，便于定量，但高水平加標醬油樣品，回收率偏低。
三、醬油樣品優(yōu)化實驗 GB 5009.298-2023
2、提取
分別稱取0.25g、0.5g、1g、2g樣品，加入8mL 水和2mL 200g/L乙酸鉛溶液，振蕩2min，超聲提取5min，6000rpm離心5min，取10mL上清液，待凈化。
4、凈化
ProElut® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）
(1)活化：依次向柱中加入5mL甲醇、5mL水，棄去流出液；
(2)上樣：將待凈化液加入柱中，棄去流出液（控制流速不超過每秒1滴）；(3)淋洗：向柱中加入5mL 20%甲醇水溶液，棄去流出液；
(4)洗脫：向柱中加入3mL甲醇，收集流出液；(5)定容：將洗脫液在50℃下減壓蒸干，用流動相定容至1mL，疏水PTFE濾膜過濾，供HPLC分析。
流速：1.0mL/min
進樣量：20μL柱溫：35℃
檢測器：ELSD溫度：40℃
壓力：4.0barGain：4
流動相：A：水；B：乙腈，A:B=89:11。當檢測樣品基質復雜，強保留物質影響后續(xù)檢測時，可采取梯度洗脫程序，梯度設置如下：
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6、添加回收結果及色譜圖
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1. 食品安全國家標準GB5009.298-2023第一法重現(xiàn)的結果中，前處理方法5.2.2 醋、醬油、醬及醬制品類試樣在目標峰位置出現(xiàn)基線不平不便于定量的問題，使用優(yōu)化方法后，醬油和甜面醬樣品在三氯蔗糖目標峰附近基線更平，無雜質干擾，便于定量，并簡化了流程提高了實驗效率。
2. 加標水平為2000mg/kg 醬油樣品中，PLS小柱填料質量由200mg 提高到500mg后，優(yōu)化后方法的回收率由71.5%提高到82.2%；樣品稱樣量由2g降低到0.25g，優(yōu)化后方法的回收率由71.5%提高到107.7%，由此可見，增加填料質量或者降低稱樣量可以提高回收率，客戶可根據對回收率的要求，進行選擇。
3. 蒸發(fā)光散射檢測器作為質量型檢測器，響應值與溶質顆粒大小和數量有關，根據標準要求，以標準系列工作液質量濃度為橫坐標，以峰面積響應值為縱坐標，繪制對數回歸曲線，并測試線性范圍。本次實驗標準曲線取20、50、200、500、1000μg/mL，相關系數R= 0.9979365；當加入5000μg/mL時，R= 0.9940418，客戶可根據自身對曲線相關系數的要求選擇是否加入濃度為1000μg/mL以上濃度的標準品。
第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質譜法
國標重現(xiàn)實驗 GB 5009.298-2023
2、標準品配制
(1) 三氯蔗糖儲備液：稱取蔗糖標準品0.25g，用水溶解并定容至25mL，配置成濃度為10.0mg/mL的儲備液。
3、提取
3.1 白酒樣品
3.2 紅酒樣品
稱取混勻后的紅酒2g于蒸發(fā)皿中，60℃水浴上加熱30min，用10mL水分3次沖洗蒸發(fā)皿的殘渣，沖洗液全部轉移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度并搖勻，待凈化。
3.3 糖果樣品
稱取2g樣品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋振蕩3min，加入1mL乙酸鋅溶液、1mL亞鐵氰化鉀溶液，經60℃水浴加熱15min，水浴過程中注意搖散。超聲提取20min，8500r/min離心5min，取上清于25mL容量瓶中，10mL水重復提取1次，合并提取液，加水定容至刻度，混勻后轉移至50mL離心管中，加入15mL正己烷，渦旋振蕩3min，8500r/min離心5min，棄去上層正己烷，下層清液待凈化。3.4 餅干、醬油、醋
稱取2g樣品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋振蕩3min，加入1mL乙酸鋅溶液、1mL亞鐵氰化鉀溶液，超聲提取20min，8500r/min離心5min，取上清于25mL容量瓶中，10mL水重復提取1次，合并提取液，加水定容至刻度，混勻后轉移至50mL離心管中，加入15mL正己烷，渦旋振蕩3min，8500r/min離心5min，棄去上層正己烷，下層清液待凈化。
乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅，加3mL乙酸，加水溶解至100mL。亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀,加水溶解至100mL。
(1)活化：用4mL甲醇、4mL水活化；
(2)上樣：準確移取10mL試樣提取液過柱，控制流速不超過1滴/s，棄去流出液，推干小柱；(3)洗脫：加入3mL甲醇洗脫，并收集洗脫液到10mL容量瓶中，加水定容，混勻，過Nylon膜（Cat.#:37177），上機分析。
色譜柱：Leapsil® C18 100x4.6mm, 2.7μm （Cat.#:86002)
流速：0.6mL/min進樣量：1μL
柱溫：40℃流動相：A: 水 B:甲醇
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電離模式：ESI
掃描方式：負離子掃描檢測方式：多反應監(jiān)測
電噴霧電壓：-4500V霧化氣壓力：50psi
輔助氣壓力：50psi氣簾氣壓力：20psi
離子源溫度：500℃.png)
6、添加回收結果及色譜圖
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